Ounuo99002-庆大-霉素酶联免疫检测试剂盒

庆大-霉素酶联免疫试剂盒

货号：Ounuo99002

一、药物概述及检测原理

本试剂盒利用庆大-霉素抗体与庆大-霉素可产生特异性结合的性质，先在酶标板上预包被抗原，再加入标准品（样本）和庆大-霉素抗体，庆大-霉素药物与固定在酶标板上的抗原竞争庆大-霉素抗体，最后加入底物催化显色。

二、试剂盒内包含组分

v  准品工作液：0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb，1mL/瓶。

v  96孔酶标板：1块

v  11x浓缩酶标记物：1瓶（0.7mL/瓶）

v  酶标记物稀释液：1 瓶（7mL/瓶）

v  20×浓缩洗涤液：1瓶（30 mL/瓶）

v  4×浓缩复溶液：1瓶（30 mL/瓶）

v  底物A液：1瓶（7 mL/瓶）

v  底物B液：1瓶（7 mL/瓶）

v  终止液：1瓶（7mL）

v  说明书

v  盖板膜

v  自封袋

三、需要自备的设备和试剂

（1）仪器：

v  酶标仪（检测波长450nm、630nm）

v  电子天平（精度：0.01 g）

v  离心机（4000g及以上）

v  生化培养箱（可调25℃）

v  旋涡振荡器

v  微量移液器：（20μL-200μL、100μL-1000μL各一支、30-300μL八道排枪）

v  计时器

（2）试剂：（试剂均为分析纯）

v  甲醇

v  氯化钠

v  氯化-钾

v  磷酸二氢钾

v  氢氧化钠

v  十二水合磷酸-氢二钠

v  去离子水

四、样本检测步骤

1.   工作液准备

v  复溶工作液：取1份4×浓缩复溶液加去离子水3份按照1:3的比例稀释即得。

v  洗涤工作液：取1份20×浓缩洗涤液加去离子水19份按照1:19的比例稀释即得。

v  PBS缓冲液: 0.1M PBS溶液(PH=10-11)  称取13.4g十二水合磷酸-氢二钠.20g氯化钠.0.32g氢氧化钠.0.5g磷酸二氢钾.0.5g氯-化钾加去离子水溶解定溶至500ml。

v  0.1M碳酸盐缓冲液（pH=10.6）：称取4.66g无水-碳酸钠和0.5g碳酸-氢钠加入500ml去离子水溶解混匀。

v  1%三氯-乙酸溶液：称取5.0g三氯乙-酸加入500mL 去离子水溶解混匀。

v   1moL/L氢氧化钠:称取4g氢氧化钠加入100mL充分溶解混匀。

2.   样品前处理

（1）组织样本方法 （鸡肉、猪肉）(稀释倍数：20倍)

v  称取 1.0±0.05g 样本至10mL聚苯乙烯离心管中，加入3 mLPBS缓冲液（见配液5.1）,上下颠倒振摇5min。

v  放入60℃水浴环境中60min 后，取出4000g 以上，

  室温离心5min；

v  移取100μL上清液至2ml聚苯乙烯离心管中，加入400μL复溶工作液（见配液 5.1），用涡旋仪涡动  

 1min;

v  取50 μl 用于分析。

（2）肝脏样本方法 (稀释倍数：40)

v  称取 1.0±0.05g 均质物至 50mL 聚苯乙烯离心管中，加入 1.5 mL 0.1M  碳酸盐缓冲液（见配液 5.1）和 1.5mL 甲醇；

v  用涡旋仪涡动 2min， 3000g 以上， 室温离心5min；

v  移取100μL上清液至2ml聚苯乙烯离心管中，加入900μL复溶工作液（见配液 5.1），用涡旋仪涡动1min;

v  取 50 μL 用于分析。

（3）液态奶方法（稀释倍数：20）

v  移取1mL牛奶样本至2ml聚苯乙烯离心管中， 加入1mL1%三氯-乙酸（见配液 5.1） ，用涡旋仪涡动3min，

v  3000g以上，室温离心5min；

v  移取50μL上清液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入450 μL复溶工作液（见配液5.1），用涡旋仪涡动1min;

v  取 50μL 用于分析。

（4）血清方法（稀释倍数20）

v  取50μL血清至2ml聚苯乙烯离心管中，加入950μL复溶工作液（见配液5.1），用涡旋仪涡动1min;

v  取 50μL 用于分析。

（5）鸡蛋方法（稀释倍数30倍）

v  称取 1.0±0.05g 均质后的鸡蛋样本至 10ml 聚苯乙烯离心管中，2.0mL 甲醇，在加入50μL 1moL/L氢氧化钠；

v  用涡旋仪涡动 2min， 3000g 以上， 室温离心5min；

v  移取50μL上清液至2ml聚苯乙烯离心管中，加入450μl复溶工作液（见配液 5.1），用涡旋仪涡动1min;

v  取 50 μL 用于分析。

3.   检测

Ø  准备：将要使用的酶标板条插入酶标板架上，并记录各标准品和样品的位置，为减小检测值波动建议做双孔平行实验（每个样本/标准品点两孔），未使用的酶标板条用自封袋密封后，保存于2-8℃环境中以防变质；

Ø  加样：向对应微孔中加入标准品工作液/样品溶液50 μL；

Ø  酶标记物工作液配制：取1份11X浓缩酶标记物加10份酶标记物稀释液按照1:10的比例稀释即得。（注：请务必按需现混现用！）

Ø  向每孔中加入50 μL酶标记物工作液；孵育：轻轻振荡酶标板10 s，使孔内液体充分混匀后，盖好盖板膜于25℃避光反应30min；

Ø  洗涤：取出酶标板后小心揭开盖板膜，倒出板孔中液体后，在每孔加250μL洗涤工作液，浸泡15-30s后倒掉洗涤工作液，然后再加入洗涤工作液重复洗涤3~4次后，将酶标板倒置于吸水纸上，用力拍干；

Ø  显色：在每孔中加入100μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必须按体积1:1充分混合，混合液在10 min内使用，切不可使用金属容器盛装、搅拌试剂以免底物变质失效）；

Ø  孵育：轻轻振荡酶标板15 s，使孔内液体充分混匀后，盖好盖板膜于25℃避光反应15min；

Ø  终止：在反应后的微孔中加入终止液50μL/孔，底物液由蓝变黄表明终止成功。

Ø  读数：终止后的酶标板应在5 min内用酶标仪读数，建议使用450nm、630nm双波长读取酶标板吸光度值。

4.   计算结果

Ø  设各标准品（或样品）的吸光度平均值为B，零标准（浓度为0 ppb的标准品）吸光度平均值B₀以(B/B₀)×100为各标准品（或样品）对应的吸光度的百分比：

Ø  使用半对数系统代入标准品对应的吸光度的百分比，与标准品浓度拟合出标准曲线。

Ø  将待检样品吸光度的百分比代入拟合出的标准曲线方程中，即可得出样品对应的浓度，最后乘以样品相应的稀释倍数，即可得出样品中检测物含量。

五、 试剂盒参数

Ø  试剂盒灵敏度：0.1 ppb；

Ø  标准曲线范围：0.1 ppb-2.7 ppb；

Ø  板内变异系数：<5%；

Ø  板间变异系数：<15%；

Ø  B0吸光度值：>0.8；

Ø  回收率：90%±15%

Ø  试剂盒与其他药物的交叉反应率：

庆大-霉素………………………………………100.0

Ø  样品检测限：

  肝脏、鸡蛋……………………………约10 ppb

  组织……………………………………约6 ppb

  血清……………………………………约6 ppb

  液态奶………………………………约15 ppb

注：ppb=ng/mL或ng/g。

六、 分析限制

　　　本试剂盒为定量或半定量试剂盒，建议用于大量样本筛查分析。若检测结果为阳性，建议使用仪器方法开展确证实验（如GC/MS、LC-MS/MS等）。

七、 试剂盒贮存条件

Ø  试剂盒贮存温度为2-8℃，切勿冻存。

Ø  未使用完的酶标板须密封保存2-8℃的环境中。

八、 注意事项

Ø  使用试剂盒前，请务必仔细阅读说明书。

Ø  试剂盒使用前，需将盒内各组份置于实验台上回温至室温（25±2℃）（提示：约1 h）。

Ø  试剂使用前需摇匀，混合时应避免出现气泡。

Ø  枪头为一次性用品，为防止试剂交叉污染，检测过程中所用枪头不得重复使用。

Ø  请勿使用过期试剂盒，不同批号试剂盒中的试剂不得混用。

Ø  样品处理完毕后请立即分析，否则可能影响检测结果。

Ø  底物A液、底物B液均为无色透明液体，若在使用前已变成蓝色，或混合后立即变蓝，说明试剂已污染或变质。

Ø  加样过程在保证精度的前提下一定要迅速，以免反应时间差对检测结果产生影响。

Ø  终止液中含有硫酸，若不小心溅上皮肤或衣物请立即用大量清水冲洗。